激光共聚焦顯微鏡的工作原理介紹

　　激光共聚焦顯微鏡也是活細胞的動態觀察、多重免疫熒光標記和離子熒光標記觀察的有力工具。不僅可對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的“光學切片”，進行單標記或雙標記細胞及組織標本的熒光定性定量分析；還可以用于活細胞生理信號，離子含量的實時動態分析監測，粘附細胞的分選，細胞激光顯微外科和光陷阱技術等?？梢詿o損傷的觀察和分析細胞的三維空間結構。

　　激光共聚焦顯微鏡的原理是用點光源照射試樣，在焦平面上形成輪廓清晰的小光斑。光斑照射后發出的熒光被物鏡收集，沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光鏡。光譜儀將熒光直接發送到檢測器。光源和探測器前面有一個針孔，分別稱為照明針孔和檢測針孔。兩者的幾何尺寸相同，約100-200納米；與焦平面上的光斑相比，兩者是共軛的，即光斑可以通過一系列透鏡同時聚焦在照明針孔和檢測針孔上。這樣，來自焦平面的光可以會聚在檢測孔范圍內，而來自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測孔之外而無法成像。激光逐點掃描樣本，檢測到針孔后的光電倍增管也逐點獲得相應光點的共焦圖像，將其轉化為數字信號傳輸至計算機。整個焦平面的清晰共焦圖像聚集在屏幕上。

　　每個焦平面圖像實際上是樣品的光學橫截面，這種光學截面總是具有一定的厚度，也稱為光學片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，且非焦平面光被針孔過濾，因此共焦系統的景深近似為零。沿z軸掃描可實現光學斷層掃描，并在待觀察樣品的焦斑處形成二維光學切片。將X-Y平面（焦平面）掃描與z軸（光軸）掃描相結合，將連續層次的二維圖像進行累加，經專用計算機軟件處理，即可得到樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點上，使得聚焦平面外激發的熒光無法進入檢測針孔。